同种异体神经移植处置入bFGF复合降解膜论文快速发表

 　　[摘 要] 目的 探讨在异体神经移植处置入bFGF(basic fibroblast growth factor)复合降解膜，提高神经再生的效果。方法 60只大鼠随机分成A、B、C组，每组20只，所有动物左下肢坐骨神经切除2cm后，移植经冷冻处理的同种异体坐骨神经移植物。A组神经移植物经bFGF处理并在移植处置入bFGF复合降解膜，B组移植物不经bFGF处理，移植处置入不含bFGF的降解膜，C组移植物不经bFGF处理，移植处不置入降解膜。术后90、180 d行电生理、组织学、血―神经屏障等各项指标观测。结果 A组再生有髓神经纤维的数量和直径明显较B、C组的多而粗(P<0.05)，结缔组织增生较少，血―神经屏障恢复和电生理指标均优于B、C组。结论 bFGF复合降解膜有提高同种异体神经移植再生的作用。

　　[关键词] 神经移植;同种异体移植物;bFGF;神经再生

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　　Research on the effect of bFGF compound degradation membrane to allograft of nerves

　　Abstract: Objective To promote regeneration effect by placing bFGF complex degradation membrane with the ability of both promoting nerve regeneration and inhibiting connective tissue proliferation in transplantation site of xenogeneic nerve. Methods 60 rats are divided into group A, B and C. All rats‘ 2 cm of sciatic nerve cutted off in left lower limb. The nerve segment was then stored in -80 ℃ for 10 days for transplantation. Group A: the nerve segment was treated bFGF and Vc liquid and coated with bFGF membrane after transplanted. Group B: nerve segment was coated with membrane not containing bFGF. Group C: nerve segment was only transplanted. A series of studies was conducted after 90 days and 180 days after operation. Results In group A the amount and diameter of sheathed nerve fiber outnumbered that in group B and C(P<0.05). The connective tissue proliferation was sligter in group A. The electrophysiological factors and Restoration of blood nerve barrier in group A were superior to that in group B and C. Conclusion bFGF might promote nerve regeneration by interfering connective tissue proliferation which showed that it had an ability to promote regeneration of allograft of nerve.

　　Keywords: nerve transplantation; allograft; bFGF; nerve regeneration

　　自体神经移植由于供区自体神经来源有限，学者们试图用异体神经代替自体神经移植。实验研究证明，经冷冻处理的异体神经移植，可降低抗原性，提高神经再生。但由于免疫排斥反应，结缔组织增生干扰，致使神经再生受阻或错位再生，而未能成功用于临床。本实验在经冷冻处理降低抗原性的异体神经移植处，置入促进神经自身再生、抑制结缔组织增生的bFGF复合降解膜，以达到提高神经再生效果的目的。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　实验动物 采用SD大鼠60只(中国医科大学实验动物饲养中心提供)，体重350～500 g，雌雄不拘，随机分成A、B、C组，每组20只。

　　1.2 手术方法

　　用2%戊巴比妥钠25 mg/kg腹腔麻醉，左大腿术区剃毛、消毒，显露坐骨神经，切除2 cm神经段，切除的神经段经20%甘油盐水浸泡15 min后，-80 ℃冷存10 d，作为移植供体。将供体神经段在移植前复温，移植到神经缺损处。A组供体神经段先经含bFGF和降低维生素C浓度试剂的生理盐水浸泡15 min，再移植，并在缝合处包裹bFGF复合降解膜;B组和C组供体神经段移植前用生理盐水浸泡15 min，B组在缝合处包裹不含bFGF的降解膜;C组不包裹降解膜。

　　1.3 观察指标

　　1.3.1 镜下观察 取术后90 d和180 d的移植部位神经，分成近段(正常神经部位)、移植段、远段(神经再生部位)和神经远、近端缝合段等五个部分，制成不同标本。①锇酸髓鞘染色切片观察及显微图像分析测定A、B和C组有髓神经纤维的形态结构、数量和直径等差异;②透射电镜观察再生神经超微结构的变化;③连续切片Mallory和H.E染色观察各组一般组织结构尤其是结缔组织增生程度的差异。

　　1.3.2 血―神经屏障HRP示踪 按照Olssony的方法[1]，在神经移植段远侧部位的神经外周注入30%HRP(sigmaⅡ型)溶液后1 h，切取标本，制成20 μm厚的切片，HRP分布处呈棕黄色反应。观察各组血―神经屏障功能恢复的差异。

　　1.3.3 神经近端缝合段周粘连测定 按汤绵波等[2]的方法，测定术后90 d各组神经近端缝合段与其外周组织粘连程度的差异。

　　1.3.4 电生理指标测试 测定术后180 d各组腓肠肌，显示潜伏期和波幅的变化，了解其神经传导速度和有效神经纤维数，从而对比神经再生效果。

　　观测数据经t检验和方差分析。

　　2 结果

　　2.1 镜下观察

　　髓鞘染色可见有髓神经纤维的髓鞘呈黑色。术后180 d，A组移植段和远段纤维的数量明显较B、C两组多而粗，髓鞘着色也较深(图1a、b、c)，A组神经远、近两段的有髓纤维数量相似，直径差异明显。B、C组的神经远段有髓纤维数量明显较其近段的少。B、C组移植段和远段的近中央部位多出现变性、坏死、脂肪化和结缔组织增生(图1d)，A组仅见轻度结缔组织增生，A组远、近端缝合段外周结缔组织增生也明显较B、C组的轻。

　　a:A组神经远段(×100); b:B组神经远段(×100);c:A组移植段(×200);d:B组移植段(×200)

　　图1 术后180 d锇酸髓鞘染色(略)

　　术后180 d透射电镜下可见A组神经远段有髓纤维的髓鞘明显较B、C组的厚，板层清楚和着色深(图2)，而B组与C组无明显差异。各组的神经髓鞘虽尚未完全成熟至正常程度，但A组髓鞘的再生程度明显好于B、C组。

　　a:A组; b:B组神经纤维细,髓鞘薄

　　图3 术后180 d移植神经远段透射电镜照片(略)

　　2.2 血―神经屏障

　　术后90 d A组移植段大部分神经纤维间呈HRP阴性反应，仅少量神经纤维间出现HRP弱阳性反应，呈淡棕黄色(图3a)，B、C组大部神经纤维间为HRP阳性反应，呈棕黄色(图4b)。术后180 d，A组移植段的神经纤维间几乎均呈阴性反应，而B、C组神经纤维间尚有HRP阳性反应。表明A组的血―神经屏障恢复快于其他两组。

　　a:A组神经外膜呈棕黄色阳性反应，纤维间呈阴性或弱阳性反应; b:B组纤维间呈阳性反应

　　图4 术后90 d 移植段HRP示踪(×100)(略)

　　2.3 图像分析仪测定

　　术后180 d各组神经近段、远段有髓神经纤维数量和直径测定结果见表1。A组远段再生有髓神经纤维的数量和直径明显大于B、C组(P<0.01)，A组神经远、近段的有髓神经纤维直径无显著差异(P>0.05)，而B、C组神经远、近段的直径有显著性差异(P<0.05)，表明A组再生有髓神经纤维再生成熟度优于其他两组。

　　表1 术后180 d各组有髓神经纤维数量和直径比较(略)

　　*:与B、C组比较，P<0.01;#：与远段比较，P<0.05

　　2.4 神经与外周粘连定量测定

　　术后90 d各组神经近端缝合段周粘连定量测定结果(表2)， A组神经近端缝合段外周粘连程度明显较B、C组的轻(P<0.01)。

　　表2 术后90 d神经近端缝合段外周粘连测定(略)

　　2.5 电生理指标的测试

　　术后180 d腓肠肌电生理检测结果(表3)，A组潜伏期较B、C组短(P<0.05)，波幅明显较B、C组高(P<0.05)，表明A组神经传导速度快，且有效神经纤维数多。

　　表3 术后180 d腓肠肌电生理检测结果(略)

　　*：与B、C组比较，P<0.05

　　3 讨论

　　用经冷冻处理的异体神经移植物，可降低其抗原性而获得神经再生成功[3]可是迄今依然由于免疫排斥，结缔组织增生干扰，致使神经再生受阻，未能取得一个突破性进展而用于临床[4]。神经自身再生慢于免疫排斥，结缔组织增生干扰，可能是其一个重要原因。

　　许多实验证明bFGF有促进神经再生和功能恢复的作用[5-7]。外周神经损伤后内源性bFGF表达增多是损伤后的修复反应，外源性bFGF与膜受体结合，通过抑制细胞内Ca2+浓度升高，阻止神经逆或顺行溃变，以达到保护损伤神经元免于死亡，促进轴突再生的作用。雪旺氏细胞在神经损伤溃变再生中起极为重要的作用[8]，bFGF能促进雪旺氏细胞分裂增殖形成Büngner‘s 带，使神经两断端轴索不受结缔组织增生干扰而向远端伸长。本实验结果显示bFGF作为刺激因子有增强神经再生能力的作用。

　　异体神经移植由于免疫排斥反应结缔组织增生形成疤痕，阻碍了神经通过而失败。结缔组织增生即成纤维细胞在Vitamin C参与下合成胶原纤维的过程，Vitamin C缺乏时成纤维细胞增殖活力明显减退，胶原纤维合成受到抑制。本实验结果显示，A组在神经移植处包裹bFGF复合降解膜可抑制结缔组织增生干扰，膜中的bFGF能充分发挥其促进轴突生长和雪旺氏细胞分裂增殖形成更多Büngner‘s 带，增强神经再生能力的作用。未用bFGF处理的B、C组神经移植段中央均出现变性坏死结构，而A组神经移植段无变性坏死结构，同时血―神经屏障和神经传导功能恢复较快，表明bFGF有促进血管内皮细胞增殖及分化作用，促进神经损伤部位微循环重建，改善血供，有利于神经再生。

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